BWA短序列比对：建索引、比对、SAM输出

BWA（Burrows-Wheeler Aligner）是短序列比对的老牌工具，2009年发布至今仍在生信流程中占据核心地位。虽然 STAR 在 RNA-seq 中更常用，但 DNA-seq、ChIP-seq、WGS 等仍旧依赖 BWA。

实测环境：Debian 13，BWA v0.7.19，Conda安装。

1. 安装#

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conda install -c bioconda bwa -y
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bwa
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# Program: bwa (alignment via Burrows-Wheeler transformation)
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# Version: 0.7.19-r1273

BWA 实际上包含三个算法：BWA-backtrack（古老）、BWA-SW（长序列）、BWA-MEM（推荐，70bp以上的reads）。现在 99% 的场景都用 BWA-MEM。

2. 建索引——比对前必须做的#

BWA 需要参考基因组的 FM-index（基于 BWT 变换），建一次就能反复用：

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# 建索引（耗时最长的一步）
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bwa index ref.fa
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# 输出5个文件：
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# ref.fa.amb  ref.fa.ann  ref.fa.bwt  ref.fa.pac  ref.fa.sa

人类基因组建索引耗时： ~1-2 小时（16线程），占用约 5GB 额外磁盘空间。索引文件放在参考基因组同目录下就可以，比对的指定路径就自动找到。

3. BWA-MEM 比对——一行命令#

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# 单端
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bwa mem -t 8 ref.fa sample.fastq.gz > output.sam
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# 双端（最常用）
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bwa mem -t 8 ref.fa sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz > output.sam

关键参数：

参数	含义	默认值	建议
`-t`	线程数	1	设成 CPU 核心数，别超过
`-M`	把split alignment标记为secondary	不标记	PICARD兼容必须加
`-R`	Read Group 信息	空	必须加，否则 GATK 报错
`-k`	最小种子长度	19	灵敏度够用就行

Read Group 的重要性#

-R 参数不加的话，GATK 的后续流程会报错。标准写法：

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bwa mem -t 8 -M \
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    -R "@RG\\tID:sample1\\tSM:sample1\\tPL:ILLUMINA\\tLB:lib1" \
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    ref.fa \
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    sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz \
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    > output.sam

RG 字段说明：

ID：Read Group 唯一标识（随意起，但每个样本不同）
SM：样本名（GATK 按这个分组）
PL：测序平台（ILLUMINA/PACBIO/ONT）
LB：文库名

4. 比对后处理——SAM→sorted BAM#

比对输出是未排序的 SAM，需要转 BAM + 排序 + 建索引：

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# SAM→BAM→sort→index 一条龙
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bwa mem -t 8 -M \
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    -R "@RG\\tID:s1\\tSM:s1\\tPL:ILLUMINA" \
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    ref.fa R1.fastq.gz R2.fastq.gz | \
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samtools sort -@ 8 -o sorted.bam && \
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samtools index sorted.bam

5. BWA vs Bowtie2 怎么选#

特性	BWA-MEM	Bowtie2	HISAT2
最佳读长	70bp-1Mbp	50-1000bp	RNA-seq专用
速度	快	较快	快
灵敏度	高	中	RNA-seq最高
间隙比对	支持长间隙	支持	支持但特殊场景
适用	WGS/ChIP/长读	小基因组	RNA-seq首选

简单决策： DNA-seq用BWA，RNA-seq用HISAT2或STAR，宏基因组用Bowtie2。

6. 踩坑#

坑1：-M忘了加导致Picard报错——BWA对嵌合比对会输出多条记录，不加-M的话Picard的MarkDuplicates处理会出错。

坑2：索引版本不兼容——bwa v0.6的索引在v0.7不兼容。升级bwa后必须重新 bwa index。

坑3：内存不足——比对人类基因组需要约8-10GB RAM。加上-t参数不要超过物理内存限制。

7. 小结#

BWA-MEM + -M -R + samtools sort 三件套是常用操作。

本文于 2025-04-25 实测。BWA v0.7.19。